在模擬太空微重力環(huán)境下培養(yǎng)小鼠腦類器官，需結(jié)合微重力培養(yǎng)系統(tǒng)與傳統(tǒng)腦類器官培養(yǎng)技術(shù)，通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)、分化及動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件，提升類器官的成熟度與生理相關(guān)性。以下為具體培養(yǎng)方法及要點(diǎn)：

一、培養(yǎng)流程

1.誘導(dǎo)擬胚體（EB）形成

當(dāng)人多能性干細(xì)胞（ESCs/iPSCs）在6孔板中長(zhǎng)到融合度為70%~80%時(shí)，用于誘導(dǎo)EB。

用無(wú)鈣鎂的D-PBS洗滌細(xì)胞后，加入含0.5mM EDTA的無(wú)鈣鎂D-PBS溶液，輕柔吸出EDTA溶液，加入Accutase酶解細(xì)胞。

用mTeSR1培養(yǎng)基吹散克隆，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，離心后重懸細(xì)胞于含ROCK抑制劑Y-27632的低bFGF ESCs培養(yǎng)基中。

將細(xì)胞懸液放入96孔板中，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后可見(jiàn)有清晰邊緣的小EB形成。

2.早期胚層分化

隔天輕柔地吸去半量培養(yǎng)基，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加Y-27632和FGF-2，直到EB直徑大于350~450μm為止。

當(dāng)EB直徑達(dá)到350~600μm時(shí)，改用無(wú)添加劑的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

3.原始神經(jīng)上皮的誘導(dǎo)

當(dāng)EB直徑達(dá)到500~600μm且邊緣光滑、透亮度顯著增加時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至低吸附24孔板中，加入神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

48小時(shí)后補(bǔ)加神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4~5天，直至神經(jīng)外胚層分化特征顯現(xiàn)，假?gòu)?fù)層上皮呈現(xiàn)放射狀結(jié)構(gòu)。

4.Matrigel包埋與靜態(tài)培養(yǎng)

將神經(jīng)外胚層組織轉(zhuǎn)移至Matrigel液滴中，進(jìn)行包埋。

將包埋好的組織置于培養(yǎng)箱中靜態(tài)培養(yǎng)，觀察組織形態(tài)變化。

5.動(dòng)態(tài)培養(yǎng)（模擬微重力環(huán)境）

使用微重力培養(yǎng)系統(tǒng)（如北京基爾比生物公司研制生產(chǎn)的Rotary Cell Culture System），將靜態(tài)培養(yǎng)后的類器官轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中。

加入含維生素A的腦類器官分化培養(yǎng)基，將生物反應(yīng)器置于磁力攪拌平臺(tái)或培養(yǎng)箱內(nèi)軌道搖床上進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。

動(dòng)態(tài)培養(yǎng)過(guò)程中，每3~4天更換培養(yǎng)基，全程監(jiān)控類器官形態(tài)發(fā)育。

二、微重力環(huán)境對(duì)小鼠腦類器官培養(yǎng)的影響

1.促進(jìn)三維結(jié)構(gòu)形成：微重力環(huán)境通過(guò)降低流體剪切力和重力沉降效應(yīng)，使細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下自由組裝，形成更接近真實(shí)大腦的三維立體結(jié)構(gòu)。

2.提升神經(jīng)血管單元構(gòu)建能力：微重力環(huán)境可促進(jìn)多種細(xì)胞類型的共培養(yǎng)，如誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞與神經(jīng)祖細(xì)胞自發(fā)形成“神經(jīng)血管單元”，模擬血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能。

3.增強(qiáng)電生理功能：研究表明，微重力環(huán)境下培養(yǎng)的腦類器官中，神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的電活動(dòng)更活躍，且能形成功能性突觸連接，接近胎兒大腦的發(fā)育水平。

4.優(yōu)化發(fā)育過(guò)程力學(xué)調(diào)控：微重力系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)參數(shù)（如旋轉(zhuǎn)速度），可模擬胚胎神經(jīng)管形成時(shí)的低剪切力環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)上皮細(xì)胞的極化和神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)的生成。

三、培養(yǎng)過(guò)程中的注意事項(xiàng)

1.細(xì)胞狀態(tài)監(jiān)測(cè)：在培養(yǎng)過(guò)程中，需定期觀察細(xì)胞和類器官的形態(tài)變化，確保培養(yǎng)條件的適宜性。

2.培養(yǎng)基更換：根據(jù)培養(yǎng)體系的不同，定期更換培養(yǎng)基以維持營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和代謝廢物清除。

3.避免機(jī)械應(yīng)力干擾：傳統(tǒng)攪拌式培養(yǎng)易產(chǎn)生較強(qiáng)的機(jī)械應(yīng)力，可能損傷脆弱的神經(jīng)前體細(xì)胞。微重力培養(yǎng)通過(guò)溫和的流體運(yùn)動(dòng)傳遞營(yíng)養(yǎng)和信號(hào)分子，避免機(jī)械損傷。

4.標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)條件：微重力培養(yǎng)系統(tǒng)可精確控制溫度、氣體濃度、流體動(dòng)力學(xué)等參數(shù)，減少批次間差異，提升類器官的一致性。