通過三維培養體系調控腫瘤微環境，需從細胞組成、物理結構、化學信號及動態交互四個維度綜合設計，以模擬體內腫瘤的復雜生態。以下是具體策略與技術路徑：
一、多細胞類型共培養：重構腫瘤異質性
1.核心細胞組合
腫瘤細胞：選擇患者來源的腫瘤干細胞（CSCs）或誘導多能干細胞（iPSCs）分化的腫瘤細胞，保留原始腫瘤的遺傳異質性。
基質細胞：
癌癥相關成纖維細胞（CAF）：分泌IL-6、TGF-β等因子，促進腫瘤干細胞自我更新和侵襲性。
腫瘤相關巨噬細胞（TAM）：通過M2型極化分泌IL-10、EGF，抑制免疫應答并促進血管生成。
內皮細胞：形成血管網絡，模擬腫瘤內營養供應與代謝廢物排出。
免疫細胞：引入T細胞、NK細胞或CAR-T細胞，構建免疫微環境，研究免疫逃逸機制。
2.共培養策略
分層接種：先鋪Matrigel基質，再依次接種CAF、內皮細胞，最后覆蓋腫瘤細胞，形成空間分層結構。
混合接種：將腫瘤細胞與CAF按1:1比例混合后嵌入基質膠，促進細胞間直接接觸。
動態灌注：結合微流控芯片實現培養基持續流動，模擬體內血液灌注，維持細胞活性。
3.功能驗證
侵襲性評估：通過Transwell實驗檢測共培養后腫瘤細胞的遷移能力。
血管生成檢測：使用CD31抗體標記內皮細胞，量化血管網絡密度與分支長度。
免疫響應分析：流式細胞術檢測T細胞活化標志物（如CD69、IFN-γ）表達水平。
二、基質膠與生物材料優化：模擬細胞外基質（ECM）
1.基質膠成分調整
硬度調控：通過調整Matrigel濃度（2-10 mg/mL）改變基質硬度，模擬正常組織（0.5-1 kPa）與腫瘤組織（10-50 kPa）的力學差異。
功能化修飾：
摻入RGD肽序列增強細胞黏附。
添加透明質酸（HA）或膠原蛋白IV，模擬腫瘤ECM的組成復雜性。
降解性控制：引入光交聯或酶敏感基團，實現基質動態重塑，模擬體內ECM降解過程。
2.新型生物材料應用
水凝膠體系：
聚乙二醇（PEG）水凝膠：通過化學交聯調節孔徑（50-200 μm），控制營養擴散速率。
海藻酸鈉水凝膠：結合Ca2?交聯實現可注射性，適用于原位腫瘤模型構建。
3D打印支架：
使用聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）打印多孔支架（孔徑100-300 μm），提供結構支撐并引導細胞定向生長。
負載生長因子（如EGF、VEGF）實現局部緩釋，模擬旁分泌信號梯度。
三、化學信號調控：模擬腫瘤微環境因子網絡
1.關鍵因子添加
促炎因子：IL-6（50 ng/mL）、TNF-α（20 ng/mL）激活NF-κB通路，促進腫瘤細胞增殖與存活。
生長因子：EGF（50 ng/mL）、HGF（20 ng/mL）驅動腫瘤干細胞自我更新。
代謝物：乳酸（10 mM）模擬腫瘤酸性微環境，誘導TAM向M2型極化。
缺氧模擬：通過化學缺氧劑（如CoCl?，100 μM）或低氧培養箱（1% O?）激活HIF-1α通路，促進血管生成與代謝重編程。
2.動態信號調控
微流控芯片控制：通過多通道泵實現因子濃度梯度（如0-100 ng/mL VEGF梯度），模擬體內旁分泌信號分布。
光控釋放系統：將生長因子包裹在光敏脂質體中，通過近紅外光觸發釋放，實現時空精準調控。
反饋調節回路：結合傳感器細胞（如表達熒光報告基因的HEK293細胞）實時監測因子濃度，并通過微泵自動調整添加量。
四、物理微環境調控：力學與拓撲結構影響
1.基質硬度調節
軟基質（0.5-1 kPa）：模擬正常組織，抑制腫瘤細胞侵襲。
硬基質（10-50 kPa）：模擬腫瘤組織，通過YAP/TAZ通路激活促癌基因表達。
硬度梯度：構建從軟到硬的基質梯度，誘導腫瘤細胞定向遷移（類似趨觸性）。
2.拓撲結構設計
微溝槽：在基質表面刻蝕寬度5-20 μm的溝槽，引導腫瘤細胞沿溝槽定向排列，模擬體內組織纖維走向。
納米圖案化：通過電子束光刻制備納米柱陣列（直徑100 nm，間距200 nm），調控細胞膜受體分布與信號轉導。
3D孔隙結構：使用鹽析法或氣體發泡法制備多孔支架（孔徑50-200 μm），促進細胞浸潤與營養交換。
3.流體剪切力模擬
層流剪切：在微流控芯片中設置流速0.1-1 dyn/cm2的層流，模擬腫瘤內間質液流動，影響細胞形態與基因表達。
湍流剪切：通過障礙物設計產生湍流（流速>10 dyn/cm2），模擬血管內血流沖擊，研究腫瘤細胞機械轉導機制。
五、動態監測與反饋調控
1.實時成像技術
共聚焦顯微鏡：觀察細胞間相互作用（如CAF與腫瘤細胞的突觸連接）。
光聲成像：監測血管生成過程中的血氧飽和度變化。
拉曼光譜：無標記檢測細胞代謝物（如乳酸、谷氨酰胺）分布。
2.AI輔助分析
深度學習模型：訓練卷積神經網絡（CNN）自動識別類器官形態變化（如褶皺形成、空腔擴張）。
多組學整合：結合轉錄組、蛋白組與代謝組數據，構建腫瘤微環境調控網絡圖譜。
3.閉環反饋系統
硬件層：微流控芯片、微泵、傳感器集成化設計。
軟件層：通過Python腳本實現數據實時采集與因子濃度動態調整。
應用案例：MIT開發的“腫瘤芯片”系統，可自動維持類器官生長所需的O?、CO?與pH值，并實時反饋調整培養基成分。
